一、儀器原理 

分光光度計用于有色溶液的定量比色分析。 

    溶液中的有色物質(zhì)對光的吸收具有選擇性【注1】。如圖0-29所示，當某單色光通過溶液時，其能量就會因被吸收而減弱，光能量減弱的程度與物質(zhì)的濃度有一定的比例關系，服從郎伯-比爾（Lambert-Beer）定律： 

                A = kcl 

   式中A為吸光度，它是入射光強度I0與透射光強度It比值的對數(shù)，即 

A=lg（I0/It），c為有色溶液的濃度，l為液層的厚度，k為吸光系數(shù)，它與入射光的波長以及溶液的性質(zhì)、溫度有關。 

分光光度計是按上述物理光學的基本原理設計的。現(xiàn)以721型分光光度計為例，簡單說明之。 

I0 -入射光強度  It -投射光強度 

          c -溶液濃度     l -液層厚度 

        圖0-29 光的吸收示意圖 

儀器由電源穩(wěn)定器、單色光器和微安計等三部分組成【注2】。 

 電源穩(wěn)定器的作用是對光源提供穩(wěn)定的電壓（即電流），以確保在測量過程中入射光強度的恒定。單色光器的作用是利用棱鏡對各種波長的光有不同的折射率，使白光分散成各種單色光，使其透過溶液，后經(jīng)光電管轉(zhuǎn)換為電信號，并在微安計上以吸光度A或透光率T（T=（I0/It）×）的形式讀出。 

儀器的光學系統(tǒng)如圖0-30所示。 

1.光源；2.聚光透鏡；3.反射鏡；4.狹縫；5.棱鏡；6.準直鏡； 

7.聚光透鏡；8.比色皿；9.光門；10.光電管；11.微安計 

圖0-30 721型分光光度計光學系統(tǒng)示意圖 

由光源1發(fā)出的白光經(jīng)聚光透鏡2、反射鏡3反射至狹縫4，并經(jīng)準直鏡6入射到棱鏡5上，鍍鋁的棱鏡5把色散后的單色光反射，并按原來路線返回，重新通過狹縫4以及聚光透鏡7，進入比色皿8，被有色溶劑吸收后的透射光射入光電管10（測量時光門9被打開），光電管10所接受的光信號在這里轉(zhuǎn)換為電信號，經(jīng)電子系統(tǒng)放大，在微安計11上讀出溶液的吸光度或透射率。 

二、 操作步驟 

1.儀器未接通電源前，先檢查微安計1（參見圖0-31）上指針是否指在零處（即透光率T=0或吸光度A=∞），若指針不指在零處，則需籍微安計1上的螺絲調(diào)節(jié)之。 

2.使儀器接上電源，開通電源開關8（指示燈9亮），將儀器預熱15分鐘。 

3.用波長調(diào)節(jié)器3選擇所需波長，用靈敏度調(diào)節(jié)器7所選擇適當?shù)撵`敏度。儀器的靈敏度共分5檔，即1-5檔，靈敏度依次升高。選擇靈敏度的原則是保證在溶液位置時，能使指針指在啊“100”的前提下，盡可能采用靈敏度較低檔，這樣可使儀器有更高的穩(wěn)定性。 

      1.微安計；2.波長刻度盤；3.波長調(diào)節(jié)器；4.零點調(diào)節(jié)器；5.調(diào)節(jié)器；6.比色皿 

定位拉桿；7.靈敏度調(diào)節(jié)器；8.電源開關；9.指示燈；10.光門拉桿；11.比色皿暗箱 

                  圖0-31 721型分光光度計示意圖 

 4.打開比色皿暗箱11箱蓋（此時光門杠桿10彈出，圖中光門9擋住了透過待測比色溶液的光線），用零點調(diào)節(jié)器4調(diào)節(jié)使微安計1指針指在零處。 

 5.將盛有溶液【注3】和待測溶液【注4】的比色皿，依次垂直地放入比色皿框【注5】內(nèi)，然后將比色皿框定位在比色皿暗箱11中，輕輕放下暗箱（此時光門桿10自動被壓下，圖中光門9被打開），并使比色皿框處于溶液位置，調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)器5，使微安計1指針在“100”（即吸光度A=0，透射率T=）處。 

 6.重復操作3、4，連續(xù)幾次調(diào)整“0”、“100”，以期即可進行測定工作。 

 7.在放下比色皿暗箱11箱蓋的情況下，將比色皿定位拉桿6拉出一格（每拉出一格或推入一格時，定位裝置都會發(fā)出“喀嚓”聲，才表明比色皿處于單色光的照射中），依次測量待測溶液的吸光度。將溶液再次推入光格，核對微安計1指針是否仍在“100”處。 

 三、注意事項 

 1.在使用分光光度計進行測量過程中，為避免光電管因受光連續(xù)照射而疲勞，只有在測量時才將比色皿暗箱的箱蓋放下。 

 2.取用比色皿時，應捏持比色皿的兩側(cè)磨砂玻璃面，手不得觸及其透光面，以免沾上油污或磨損，影響其吸光度的測定。在用去離子水洗凈比色皿后，還需用待測溶液淋洗數(shù)次，再注入待測溶液（為什么？）。隨后用濾紙（或吸水紙）將沾附于比色皿外壁和底部的溶液吸干，不能留有水跡。應將比色皿垂直地放入比色皿框中（位置要妥帖），否則會由于光透過液層厚度的不同而導致測量誤差。 

 [注1]用分光光度計進行的比色測定，不同于目測比色，可以選擇各種波長的單色光作為入射光。通常根據(jù)溶液的顏色，選擇能被它大吸收的波長的光進行比色，這樣就可以獲得高的靈敏度，溶液的顏色與需選擇的光的波長成互補關系，如表0-4所示： 

表0-4 溶液顏色與互補色及選擇的波長 

[注2]721型分光光度計的這三部分是裝配成整套儀器的。721型分光光度計的這三部分是分離的，它們都有各自的電源開關。并籍導線將它們連接起來，即電源穩(wěn)定器的輸出端與單色光器連接，單色光器的輸出端與微安計（即檢流計）連接。使用72型儀器的操作步驟與721型的基本相同，僅有三處差別：一是721中的調(diào)節(jié)器在72型中為光量調(diào)節(jié)器，；是721型的光門杠桿在72型中是手動的光路閘門；三是721型微安計用指針指示讀數(shù)，在72型中是籍檢流計鏡片反射的一帶標線的光點顯示讀數(shù)。 

[注3]在測定有色溶液的吸光度時，不論是已知濃度的標準溶液，還是未知濃度的待測溶液，都需要用溶液作對比，其目的在于消除待測物質(zhì)以外其它成分對光的吸收、散射等的影響。通常采用不含待測物質(zhì)，但組成與待測溶液的組成盡可能相似的溶液作為溶液；要求不高時，也可采用去離子水代替之。 

[注4]一般儀器附有多種規(guī)格的比色皿，如1/2cm，1cm，2cm，3cm等，通?？筛鶕?jù)待測溶液的不同而進行選擇。對濃度較低的溶液，一般選用厚度較大的比色皿。但同一次實驗必須選用同一規(guī)格的比色皿。 

[注5]一般比色皿框中可安放4只比色皿，溶液防在*格內(nèi)，其余3只可按待測溶液的編號，依次放置。